一、實(shí)驗介紹

早期的shRNA載體多採用RNA聚合酶III型啟動(dòng)子介導shRNA的表達，RNA聚合酶III型啟動(dòng)子如鼠源的U6啟動(dòng)子和人源的H1啟動(dòng)子可以在哺乳動(dòng)物細胞中表達小分子RNA，隨著(zhù)miRNA干擾機制的深入研究，發(fā)展出第二代siRNA載體，即採用RNA聚合酶II型啟動(dòng)子CMW表達含測翼序列的miRNA模擬物，該載體模擬miRNA的加工，表達出來(lái)的shRNA進(jìn)入RISC沉默複合物的效率要比RNA聚合酶III型啟動(dòng)子表達的shRNA高十倍，抑制效率更好，且可以和EGP協(xié)調表達，方便觀(guān)察轉染效率

二、實(shí)驗週期

30-35工作日

三、交付標準

 >10ug shRNA載體，已確認shRNA目標基因轉染成功的細胞株，實(shí)驗報告，根據實(shí)驗要求，選擇蛋白質(zhì)檢測或分子生物學(xué)檢測

四、客戶(hù)提供

目的基因NCBI登陸號

 五、實(shí)驗流程

設計干擾靶點(diǎn)                                  

構建干擾載體         培養293T細胞       靶基因表達豐度檢測    

豐度高-內源篩選     干擾質(zhì)粒轉染293T細胞       QPCR檢測干擾效果

豐度低-外源篩選     靶基因真核表達載體構建     干擾質(zhì)粒與表達載體轉染293T細胞     QPCR檢測干擾效果