1．溶液I—溶菌液：
溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌體細胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的β-1,4糖苷鍵，因而具有溶菌的作用。當溶液中pH小于8時(shí)，溶菌酶作用受到抑制。
葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機械剪切力作用而降解。
EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對DNA的降解作用（DNase作用時(shí)需要一定的金屬離子作輔基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因為溶菌酶的反應要求有較低的離子強度的環(huán)境。

2．溶液II－NaOH－SDS液：
NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是穩定的。但當pH＞12或pH＜3時(shí)，就會(huì )引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。在溶液II中的NaOH濃度為0.2mo1／L，加抽提液時(shí)，該系統的pH就高達12.6，因而促使染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性。
SDS：SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有：（1）溶解細胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜。（2）解聚細胞中的核蛋白。(3）SDS能與蛋白質(zhì)結合成為R-O-SO3-…R＋-蛋白質(zhì)的復合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來(lái)。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取過(guò)程中，必須把它去除干凈，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA時(shí)）受到干擾。

3. 溶液III--3mol／L NaAc（pH4.8）溶液：
NaAc的水溶液呈堿性，為了調節pH至4.8，必須加入大量的冰醋酸。所以該溶液實(shí)際上是NaAc-HAc的緩沖液。用pH4.8的NaAc溶液是為了把pH12.6的抽提液，調回pH至中性，使變性的質(zhì)粒DNA能夠復性，并能穩定存在。而高鹽的3mol／L NaAc有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白復合物凝聚而沉淀之。前者是因為中和核酸上的電荷，減少相斥力而互相聚合，后者是因為鈉鹽與SDS－蛋白復合物作用后，能形成較小的鈉鹽形式復合物，使沉淀更完全。

用於質(zhì)粒提取

質(zhì)粒提取常見(jiàn)問(wèn)題分析:

• 一、未提出質(zhì)?；蛸|(zhì)粒得率較低：

  
  

  1、大腸桿菌老化

  請涂布平板培養后，重新挑選新菌落進(jìn)行液體培養。 

  2、質(zhì)?？截悢档?   

  由于使用低拷貝數載體引起的質(zhì)粒DNA提取量低，可更換具有相同功能的高拷貝數載體。

  3、菌體中無(wú)質(zhì)粒   

  有些質(zhì)粒本身不能在某些菌種中穩定存在，經(jīng)多次轉接后有可能造成質(zhì)粒丟失。

  4、堿裂解不充分   

  使用過(guò)多菌體培養液，會(huì )導致菌體裂解不充分，可減少菌體用量或增加溶液I、II和III的用量。對低拷貝數質(zhì)粒，提取時(shí)，可加倍使用溶液I、II和III，可能有助于增加質(zhì)粒提取量和質(zhì)粒質(zhì)量。

  5、溶液使用不當  

  溶液II在溫度較低時(shí)可能出現渾濁，應置于37℃保溫片刻直至溶解為清亮的溶液，才能使用。

  6、吸附柱過(guò)載  

  不同產(chǎn)品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質(zhì)粒量很大，請分多次提取。若用富集培養基，例如TB 或2×YT，菌液體積必須減少；若質(zhì)?；蛩拗骶欠浅８叩目截悢祷蛏L(cháng)率，則需調整LB培養液體積。

  7、質(zhì)粒未全部洗脫（尤其質(zhì)粒較大時(shí)）  

  洗脫溶解質(zhì)粒時(shí)，可適當加溫或延長(cháng)溶解時(shí)間。

  8、乙醇殘留  

  漂洗液洗滌后應離心盡量去除殘留液體，再加入洗脫緩沖液。

  9、洗脫液加入位置不正確  

  洗脫液應加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會(huì )完全覆蓋硅膠膜的表面達到最大洗脫效率。

  10、洗脫液不合適

  DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫，如洗脫緩沖液 (2.5 mM Tris-HCl， pH 8.5)或水。洗脫效率取決于pH值。最大洗脫效率在pH7.5-8.5間。當用水洗脫時(shí)確保其pH值在此范圍內，導致如果pH過(guò)低可能洗脫量低。洗脫時(shí)將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加熱至60℃后使用有利于提高洗脫效率。

  11、洗脫體積太小 

  洗脫體積對回收率有一定影響。隨著(zhù)洗脫體積的增大回收率增高，但產(chǎn)品濃度降低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。

  12、洗脫時(shí)間過(guò)短  

  洗脫時(shí)間對回收率也會(huì )有一定影響。洗脫時(shí)放置一分鐘可達到較好的效果。

  二、質(zhì)粒純度不高：

  1、混有蛋白  

  不要使用過(guò)多菌體。溶液I、II和III處理并離心后溶液應為澄清的，如果還混有微小蛋白懸浮物，可再次離心去除后再進(jìn)行下一步驟。

  2、混有RNA 

  RNase A處理不徹底，請減少菌體用量或加入溶液III之后室溫放置一段時(shí)間。如果溶液I已保存6個(gè)月以上，請在溶液I中添加RNase A。

  3、混有基因組DNA

  加入溶液II和III后應溫和混勻，如果劇烈振蕩，可能把基因組DNA剪切成碎片從而混雜在質(zhì)粒中。如果加入溶液II后過(guò)于粘稠，無(wú)法溫和混勻，請減少菌體用量。細菌培養時(shí)間過(guò)長(cháng)會(huì )導致細胞和DNA的降解，不要超過(guò)16 小時(shí)。

  4、Solution III溶液加入時(shí)間過(guò)長(cháng)  

  Solution III溶液加入后，放置時(shí)間不要太長(cháng)，否則有可能會(huì )產(chǎn)生小片段DNA污染。

  5、含大量核酸酶的宿主菌  

  宿主菌含大量核酸酶，在質(zhì)粒提取過(guò)程中降解質(zhì)粒DNA，影響提取質(zhì)粒DNA的完整性，最好選用不含核酸酶的大腸桿菌宿主菌，如DH5α和Top10。

  6、裂解時(shí)間過(guò)長(cháng)  

  加入溶液II后裂解時(shí)間不應超過(guò)5分鐘。菌體量合適時(shí)，裂解應該在1分鐘之內就可以完成。

  7、質(zhì)粒的二聚體、多聚體及復制中間體形式  

  
  

  質(zhì)粒復制過(guò)程中形成的，與宿主菌相關(guān)，電泳可檢測出。