Bicinchoninic acid (BCA )法是近來(lái)廣為應用的蛋白定量方法。其原理與Lowery法蛋白定量相似，即在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)與Cu²⁺絡(luò )合并將Cu²⁺還原成Cu¹⁺。BCA與Cu¹⁺結合形成穩定的紫藍色復合物，在562 nm處有高的光吸收值并與蛋白質(zhì)濃度成正比，據此可測定蛋白質(zhì)濃度。與Lowery法相比，BCA蛋白測定方法靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，試劑及其形成的紫蘭色復合物穩定性俱佳，并且受干擾物質(zhì)影響小。與Bradford法相比，BCA法的顯著(zhù)優(yōu)點(diǎn)是不受去垢劑的影響。

特點(diǎn):

• 靈敏度高：最低可檢測出25 μg/ml，0.5 μg蛋白
• 線(xiàn)性范圍廣：線(xiàn)性范圍在25 ~2500 μg/ml
• 快速簡(jiǎn)便：45分鐘內完成測定，比經(jīng)典的Lowry法快4倍而且更加方便
• 兼容性強：不受樣品中去垢劑等化學(xué)物質(zhì)的影響
• 穩定性好：蛋白間檢測變異系數遠小于Bradford法

【注意事項】

1、如果檢測效果不佳，可以室溫放置 2h 或 60℃放置 30min，顏色會(huì )隨著(zhù)時(shí)間的延長(cháng)不斷加深。

   顯色反應也會(huì )隨溫度升高而加快；如果濃度較低，可以適當延長(cháng)孵育時(shí)間或在較高溫度下孵育。

2、測定標準曲線(xiàn)時(shí)發(fā)現隨著(zhù)標準品濃度的增加吸光度或顏色沒(méi)有明顯變化，可能的原因是樣品中

   含有嚴重干擾 BCA 法測定蛋白濃度的物質(zhì)。

3、BCA 法檢測中樣本中不應含有 EDTA，否則影響檢測結果。

4、因 BCA 法測定時(shí)顏色會(huì )隨著(zhù)時(shí)間的延長(cháng)不斷加深，建議每次測定時(shí)都做標準曲線(xiàn)，并且顯色

   反應的速度和溫度有關(guān)，所以除非精確控制顯色反應的時(shí)間和溫度，否則每次都做標準曲線(xiàn)。

5、如果沒(méi)有酶標儀，也可以使用普通分光光度計測定，但應考慮根據比色皿的最小檢測體積。

   應按比例適當加大 BCA 工作液的用量使總體積不小于最小檢測體積，樣品和標準品的用量亦

   相應按比例放大；使用分光光度計測定蛋白濃度時(shí)，可以測定的樣品數量可能會(huì )顯著(zhù)減少。

6、為了加快 BCA 法測定蛋白濃度的速度可以適當加熱，但是切勿過(guò)熱，否則易失效。

7、為保證蛋白的精確定量，樣品的提取和標準蛋白的配制最好選用相同的緩沖液，同時(shí)也要保證

   兩者檢測條件的一致性。如果緩沖液本身就有較高的背景值，建議使用其他的方法測定。

根據標準曲線(xiàn)計算出待測樣品的蛋白濃度