適用于中等靈敏度檢測各種印跡膜檢測，包括Southern雜交、Northern雜交、Western blot沉淀、免疫組化等。

 

 

三種顯色方法ECL、NBT/BCIP和DAB的對比:

 

1.ECL

增強化學(xué)發(fā)光，一般含有魯米諾和H2O2、發(fā)光增強劑等物質(zhì)。發(fā)光試劑中的魯米諾被HRP和H2O2氧化，產(chǎn)生熒光，這個(gè)過(guò)程被發(fā)光增強劑加強。其中，增強劑在體系中扮演著(zhù)核心角色，決定著(zhù)ECL化學(xué)發(fā)光的發(fā)展。

理想的發(fā)光增強劑是：（1）發(fā)光靈敏，目前一般的發(fā)光增強劑都可以將發(fā)光靈敏度提高1000倍至100000倍以上；（2）發(fā)光穩定，這是目前研究的重點(diǎn)之一，發(fā)光不穩定的增強劑，容易在一些情況下發(fā)生“淬滅”，不容易被檢測到；（3）本底或背景低，這也是發(fā)展的方向之一，欲得到準確可靠的結果，就必須確保試劑的特異性，在無(wú)HRP或很少HRP的情況下，不發(fā)光或很少發(fā)光。

 

2.NBT/BCIP:

是堿性磷酸酶最佳的底物組合之一。在堿性磷酸酶（AP）的催化下，BCIP會(huì )被水解而產(chǎn)生強反應性產(chǎn)物，該產(chǎn)物與NBT發(fā)生反應，形成不溶性的深藍色至藍紫色化學(xué)物。該試劑盒可用于堿性磷酸酶系統的IHC和WB實(shí)驗的酶促顯色。在A(yíng)P的催化下，在組織切片或印跡膜上結合了AP偶聯(lián)物的地方產(chǎn)生深藍色沉淀，可根據顏色反應來(lái)確定目的蛋白的位置及表達情況。

 

3.DAB:

二氨基聯(lián)苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）是過(guò)氧化物酶的顯色底物，在過(guò)氧化氫的存在下失去電子而呈現出顏色變化和積累，形成棕褐色不溶性產(chǎn)物，并就地原位沉淀。顯色反應原理如下：

 

HRP＋H2O2+DAB→HRP＋H2O＋氧化型DAB↓

該方法特異性好，性能穩定，操作便捷，適用于蛋白質(zhì)雜交和免疫化學(xué)，其終產(chǎn)物可直接在普通環(huán)境下觀(guān)察，但靈敏度是這三種方法中最低的，僅能達到500pg。

 

綜合如上所述，ECL和DAB都是HRP的底物，NBT/BCIP的酶是堿性磷酸酶。而且三者的顏色顯示不同，DAB的顯色是棕褐色，NBT/BCIP顯藍色，ECL顯熒光。在靈敏度方面，ECL化學(xué)發(fā)光的靈敏度最高，為1~5pg，也有達到fg級的，BCIP/NBT的靈敏度100pg，DAB的靈敏度最低，大約為500pg。在試驗中進(jìn)行選擇時(shí)，可根據不同的酶以及靈敏度等進(jìn)行選擇，并且注意操作時(shí)應佩戴手套，避免將顯色劑與皮膚接觸，用后及時(shí)徹底沖洗。