甘氨酸是最簡(jiǎn)單的一種氨基酸,是兩性分子,在不同pH情況下解離程度不同。
這樣由于濃縮膠和分離膠的pH的差別,導致在兩者中甘氨酸根含量不同,形成不同強度的電場(chǎng),從而達到濃縮/分離的目的。
Tris-HCL是緩沖體系,主要用于維持pH穩定。因為膠中也含有Tris,所以采用成分相似的緩沖液可以保持相對穩定。
電泳緩沖液里還有個(gè)SDS,可以消除不同蛋白之間的電荷和結構差異,使蛋白的依照大小分離。
產(chǎn)品特點(diǎn):
1.純度保證能夠達到99.0%以上,以及其余各項指標都能達到蛋白組學(xué)級。
2.配制1M水溶液,PH值范圍是5.9-6.4
3.配制蛋白電泳緩沖液,使用預染蛋白Marker進(jìn)行電泳,可以得到清晰的Marker條帶,無(wú)條帶缺失或者位置不準現象。
4.配制蛋白轉印緩沖液,也能將清晰的條帶完整地轉移到膜上。
科研 實(shí)驗,用于免疫組化實(shí)驗,WB實(shí)驗,相應的標記抗體有HRP標記抗體,FITC標記,BIO等。
運用在Western blotting、Immunohistocry、ELISA、IF、IHC-P、IHC-F等系列實(shí)驗
Q:配膠緩沖液系統對電泳的影響?
A:在SDS-PAGE不連續電泳中,制膠緩沖液使用的是Tris-HCL緩沖系統,濃縮膠是pH6.7,分離膠pH8.9;而電泳緩沖液使用的Tris-甘氨酸緩沖系統。在濃縮膠中, 其pH環(huán)境呈弱酸性,因此甘氨酸解離很少,其在電場(chǎng)的作用下,泳動(dòng)效率低;而CL離子卻很高,兩者之間形成導電性較低的區帶,蛋白分子就介于二者之間泳 動(dòng)。由于導電性與電場(chǎng)強度成反比,這一區帶便形成了較高的電壓剃度,壓著(zhù)蛋白質(zhì)分子聚集到一起,濃縮為一狹窄的區帶。當樣品進(jìn)入分離膠后,由于膠中pH的 增加,呈堿性,甘氨酸大量解離,泳動(dòng)速率增加,直接緊隨氯離子之后,同時(shí)由于分離膠孔徑的縮小,在電場(chǎng)的作用下,蛋白分子根據其固有的帶電性和分子大小進(jìn) 行分離。
所以,pH對整個(gè)反應體系的影響是至關(guān)重要的,實(shí)驗中在排除其他因素之后仍不能很好解決問(wèn)題的情況,應首要考慮該因素。
Q:樣品如何處理?
A:根據樣品分離目的不同,主要有三種處理方法:還原SDS處理、非還原SDS處理、帶有烷基化作用的還原SDS處理。
1、還原SDS處理:在還原劑中加入SDS和DTT(或Beta巰基乙醇)后,蛋白質(zhì)構象被解離,電荷被中和,形成SDS與蛋白相結合的分子,在電泳 中,只根據分子量來(lái)分離。一般電泳均按這種方式處理,樣品稀釋適當濃度,加入上樣Buffer,離心,沸水煮5min,再離心加樣。
2、帶有烷基化作用的還原SDS處理:碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并經(jīng)久牢固的保護SH基團,得到較窄的譜帶;另碘乙酸胺可捕集過(guò)量的DTT,而防止銀染時(shí)的紋理現象。100ul樣品緩沖液中10ul 20%的碘乙酸胺,并在室溫保溫30min。
3、非還原SDS處理:生理體液、血清、尿素等樣品,一般只用1%SDS沸水中煮3min,未加還原劑,因而蛋白折疊未被破壞,不可作為測定分子量來(lái)使用。
Q:SDS-PAGE電泳凝膠中各主要成分的作用?
A:聚丙烯酰胺的作用:丙烯酰胺與為蛋白質(zhì)電泳提供載體,其凝固的好壞直接關(guān)系到電泳成功與否,與促凝劑及環(huán)境密切相關(guān);
制膠緩沖液:濃縮膠選擇pH6.7,分離膠選擇pH8.9,選擇tris-HCL系統,具體作用后面介紹;
TEMED與AP:促凝作用,加速聚丙烯酰胺的凝固;
十二烷基硫酸鈉(SDS):陽(yáng)離子去污劑,作用有四:去蛋白質(zhì)電荷、解離蛋白質(zhì)之間的氫鍵、取消蛋白分子內的疏水作用、去多肽折疊。
Q:提高SDS-PAGE電泳分辨率的途徑?
A:1、聚丙烯酰胺的充分聚合,可提高凝膠的分辨率。建議做法:待凝膠在室溫凝固后,可在室溫下放置一段時(shí)間使用。忌即配即用或4度冰箱放置,前者易導致凝固不充分,后者可導致SDS結晶。一般凝膠可在室溫下保存4天,SDS可水解聚丙烯酰胺。
2、一般常用的有氨基黑、考馬斯亮藍、銀染色三種染料,不同染料又各自不同的染色方法,具體可參照郭堯君編著(zhù)的《蛋白質(zhì)電泳技術(shù)手冊》P82-103。
Q:“微笑”(兩邊翹起中間凹下)形帶原因?
A:主要是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致,多出現于較厚的凝膠中。
處理辦法:待其充分凝固再作后續實(shí)驗。
Q:“皺眉”(兩邊向下中間鼓起)形帶原因?
A:主要出現在蛋白質(zhì)垂直電泳槽中,一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。
處理辦法:可在兩板間加入適量緩沖液,以排除氣泡。
Q:為什么帶出現拖尾現象?
A:主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過(guò)大引起的。
處理辦法:加樣前離心;選擇適當的樣品緩沖液,加適量樣品促溶劑;電泳緩沖液時(shí)間過(guò)長(cháng),重新配制;降低凝膠濃度。
Q:為什么帶出現紋理現象?
A:主要是樣品不溶性顆粒引起的。
處理辦法:加樣前離心;加適量樣品促溶劑。
Q:什么是“鬼帶”,如何處理?
A:“鬼帶”就是在跑大分子構象復雜的蛋白質(zhì)分子時(shí),常會(huì )出現在泳道頂端(有時(shí)在濃縮膠中)的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀,主要由于還原劑在 加熱的過(guò)程中被氧化而失去活性,致使原來(lái)被解離的蛋白質(zhì)分子重新折疊結合和亞基重新締合,聚合成大分子,其分子量要比目標條帶大,有時(shí)不能進(jìn)入分離膠。但 它卻于目標條帶有相同的免疫學(xué)活性,在WB反應中可見(jiàn)其能與目標條帶對應的抗體作用。
處理辦法:在加熱煮沸后,再添加適量的DTT或Beta巰基乙醇,以補充不足的還原劑;或可加適量EDTA來(lái)阻止還原劑的氧化。
Q:為什么溴酚藍不能起到指示作用?
A:我們在實(shí)驗中常會(huì )遇到溴酚藍已跑出板底,但蛋白質(zhì)卻還未跑下來(lái)的現象。主要與緩沖液和分離膠的濃度有關(guān)。
處理辦法:更換正確pH值的Buffer;降低分離膠的濃度。
Q:為什么電泳的條帶很粗?
A:電泳中條帶很粗是常見(jiàn)的事,主要是未濃縮好的原因。
處理辦法:適當增加濃縮膠的長(cháng)度;保證濃縮膠貯液的pH正確(6.7);適當降低電壓;
Q:為什么電泳電壓很高而電流卻很低呢?
A:這種現象一般初學(xué)者易出現。比如電壓50v以上,可電流卻在5mA以下。主要是由于電泳槽沒(méi)有正確裝配,電流未形成通路。包括:a.內外槽裝反;b.外槽液過(guò)少;c.電泳槽底部的絕緣體未去掉(比如倒膠用的橡膠皮)。
處理辦法:電泳槽正確裝配即可。
Q:濃縮膠與分離膠斷裂、板間有氣泡對電泳有影響嗎?
A:這主要出現在初學(xué)者中,一般對電泳不會(huì )有太大的影響。前者主要原因是拔梳子用力不均勻或過(guò)猛所致;后者是由于在解除制膠的夾子后,板未壓緊而致空氣進(jìn)入引起的。
處理辦法:按正確的操作方法操作。