重組蛋白表達實(shí)驗中,經(jīng)常會(huì )遇到需要表達10kd一下的目的蛋白,常規的SDS-PAGE若是用來(lái)跑小分子蛋白,
會(huì )造成模糊不清,膠質(zhì)過(guò)軟,甚至跑不出來(lái)等情況。
而Tricine膠可以很好的解決10kd以下的小分子蛋白鑒定問(wèn)題。
Tricine膠比較容易將樣品壓平,跑出來(lái)的Marker又細又直。
同樣,顯出來(lái)的條帶也壓的很好。
與普通的SDS-PAGE膠跑出來(lái)的結果相比,Marker擴散沒(méi)有那么厲害,各泳道條帶間隔明顯,
不像普通膠的條帶容易連到一起。
10x Tricine-SDS-Buffer(外槽)配方如下:1L
Tris-Base 93.84g
Tris-HCl 35.46g
加水至800ml,用HCl調整pH至8.9,用水定容至1L。
本緩沖液是Tricine-SDS-PAGE的外槽緩沖液(陽(yáng)極)。
內外槽電泳液的體積置配參考,一般電泳槽內槽一次只要200mL液體,而外槽需要400-500mL液體。
傳統實(shí)驗手法建議:
制膠時(shí),分離膠做好后加水壓平,一般20min左右凝固。
為了避免樣品漏的問(wèn)題,可在分離膠凝固后(表現為分層處出現一條清晰的分界線(xiàn)),先不急著(zhù)把水控干,
而是配置積層膠,先不加APS和TEMED,再空出水(槍頭沿一邊吸盡即可),
再在積層膠里加入APS,TEMED,迅速混勻,先取少量膠液灌入板內,輕輕搖晃幾下,潤一遍,棄掉這些膠液,
這時(shí)候盡量去干凈,動(dòng)作要快。再正式灌滿(mǎn)膠液,插上梳齒。
跑電泳時(shí),可以60V先壓約30min,可以看到溴酚藍變的又細又直,待進(jìn)入分離膠,
可以看到預染的Marker已經(jīng)分離,就可以將電壓調至120V跑完。
轉膜與普通一樣,建議30V恒壓轉2小時(shí)(用于80KD以下的蛋白分子),如果有更大的蛋白280KD的mTor,
可以2h后再加350mA 30min,效果很好,280KD以下90KD以上的都可以加350mA這一步,時(shí)間根據分子量來(lái)定。
90KD加15min即可。