1 做熒光定量PCR之前，考慮到的是你能接觸到什么機型的PCR儀，不同的PCR儀兼容的耗材以及試劑不一樣的，如果你沒(méi)有別人帶，自己第一次做，一定要注意。

2 做熒光定量PCR最重要的莫過(guò)于，引物和模板的準備。提取RNA之后一定要電泳檢測其降解狀態(tài)，如果發(fā)生了降解很容易導致結果偏差；引物設計的好壞直接關(guān)系著(zhù)后續實(shí)驗的成功，所以引物合成回來(lái)，可以做個(gè)普通的pcr，跑電泳驗證其特異性。如果同時(shí)要檢測很多的基因，那么設計的時(shí)候，引物的Tm最好都相近在60度左右，擴增產(chǎn)物150bp左右最好，有利于操作。

3 熒光定量PCR的體系確定，大的體系容錯率可能稍微高一點(diǎn)，小的體系對操作的精度和準度要求比較高，但是可以很好的的節省cDNA模板。如果沒(méi)有電動(dòng)的分液槍?zhuān)炀毜氖褂闷胀ㄒ埔浩鳌?/p>

4 進(jìn)行具體實(shí)驗之前，要測定引物的擴增效率，通常來(lái)說(shuō)，比較兩種處理中基因表達的差異是需要內參基因的，這樣的比較，是假定興趣基因引物以及內參基因的擴增效率相同且為1的。如果引物太多，可以看熒光定量PCR的擴增曲線(xiàn)，如果形態(tài)相近的話(huà)，一般也認為擴增效率是一致的。

5 熒光定量PCR最少設置三個(gè)技術(shù)性重復組，同時(shí)一定要有空白對照組，有很多人沒(méi)有這種習慣，其實(shí)很危險。

6 熒光定量PCR的程序和普通PCR不同，會(huì )多一個(gè)melting的部分，同時(shí)三步循環(huán)中延伸的部分可以去掉，節省時(shí)間。

7 熒光定量PCR結束之后要去看下溶解度曲線(xiàn)，每種擴增產(chǎn)物的曲線(xiàn)為單峰既Ok

8 數據的處理，這部分首先要根據sd值判斷數據質(zhì)量。如果重復組數據波動(dòng)很大，則會(huì )導致結果不可信，當然如果設置的重復組較多，有些明顯的單個(gè)異常值可以去掉，優(yōu)化數據。最后需要根據不同的目的來(lái)對數據進(jìn)行不同的計算處理。