最好選擇兩個(gè)不同種源的抗體。選擇同一種源的抗體的問(wèn)題在于：在WB之前進(jìn)行的蛋白變性這一步，由于加樣緩沖液中含有巰基乙醇，巰基乙醇會(huì )把抗體的重鏈和輕鏈之間的二硫鍵破壞，從而使的抗體變成重鏈分子55KD和輕鏈分子25KD。假設你IP的抗體是兔抗的，目的蛋白進(jìn)行WB的抗體也是兔抗的，而且目的蛋白的分子量為55KD，可以想象，55KD的位置除了你的目的蛋白以外，還有IP抗體的重鏈IgG。由于IP的抗體用量非常大（1ug），就導致55KD處的信號會(huì )非常強。如果你用抗兔的二抗進(jìn)行顯色，那么55KD處的ip抗體的重鏈和你的目的蛋白會(huì )重疊在一起，無(wú)法分辨。
然而這個(gè)時(shí)候如果你的目的蛋白進(jìn)行WB的抗體不是兔抗的，比如小鼠抗的，那么就需要用抗小鼠的二抗進(jìn)行顯色，而抗小鼠的二抗是無(wú)法跟兔抗的IP抗體發(fā)生反應的。因此55KD位置的IP抗體的重鏈IgG就無(wú)法顯色，發(fā)生反應的就是你的目的蛋白了。