ㄧ.無(wú)菌操作

細胞培養最看重的就是無(wú)菌操作，無(wú)菌操作是細胞培養是否成功的關(guān)鍵點(diǎn)。

1、使用前用75%的乙醇擦拭細胞間的桌面、超凈臺、孵箱和離心機等；紫外照射細胞間和超凈臺30分鐘以上才可以進(jìn)入使用。

2、進(jìn)入細胞間必須穿上隔離服或者細胞間專(zhuān)用的白大衣，戴上手套和口罩，換上拖鞋，嚴格意義上來(lái)說(shuō)，帽子也是要帶的。除了隔離服，其他穿著(zhù)物品最好一次性使用。

3、凡是放入超凈臺中的不是一次性使用的物品事先都需要經(jīng)過(guò)高壓滅菌；不能進(jìn)行高壓處理的物品也需要經(jīng)過(guò)75%的乙醇消毒。包括酒精燈、吸管、移液器、試管架、培養皿、廢液缸等。

4、操作過(guò)程中盡量接近酒精燈；用鑷子拿取槍頭、離心管、吸管等物品時(shí)，避免碰到使用端；不要在開(kāi)口器皿的上端進(jìn)行操作。

5、細胞間的設計都是一層層的隔間，每一層隔間的拉門(mén)都必須關(guān)好；當有人在超凈臺工作時(shí)，其他人員不允許進(jìn)入操作區域。

二、培養基

1、培養基的選擇依細胞種類(lèi)而定。如果是從別的實(shí)驗室借來(lái)的細胞，最初階段一定要保持細胞原有的培養條件；特殊種類(lèi)的細胞，比如內皮細胞，可以借鑒網(wǎng)上培養成功的條件，添加一些特定成分。

2、液體培養基的保存條件應是冰箱4度冷藏。小六兒見(jiàn)過(guò)有的大實(shí)驗室細胞量多，一次性購買(mǎi)的培養基瓶數也多，有些人可能覺(jué)得-20冰箱保存時(shí)間會(huì )更久一些。但是經(jīng)過(guò)冷凍后的培養基再溶化時(shí)，你會(huì )發(fā)現培養基的顏色發(fā)生變化，顏色變深，這就是培養基的PH值升高了。

3、培養基中都含有大量的谷氨酰胺，用來(lái)合成細胞生長(cháng)所需要的核酸和蛋白質(zhì)。但是谷氨酰胺在溶液中不穩定，保存4周后的培養基需要重新加入谷氨酰胺。所以盡量不要大批量購買(mǎi)培養，也不要一次配太多的培養基。

4、細胞適合的培養基PH值是7.2-7.4，偏高或偏低都不好，但相對于堿性條件而言，細胞更耐酸。原代細胞對PH值的變化很敏感，而永生性細胞相對來(lái)說(shuō)忍受力更強一些。

5、造成皿或瓶?jì)扰囵B基PH值變化的原因有很多：細胞增殖速度的快慢、孵箱內二氧化碳的濃度不準確、培養瓶的蓋子擰緊或者發(fā)生了污染。如果發(fā)現細胞生長(cháng)過(guò)慢，刨除細胞本身狀態(tài)的原因，可以在培養液中添加丙酮酸鈉（丙酮酸鈉是糖酵解的中間產(chǎn)物，為細胞生長(cháng)提供ATP，提供合成大代謝所需要的碳源，使用濃度通常是0.1mM）。

6、細胞發(fā)生污染，培養基的PH值也會(huì )發(fā)生變化。如果新配置的培養基出現沉淀，很可能是廣口瓶沒(méi)有清洗干凈，瓶中殘留的磷酸鹽造成培養基成分的析出。

7、孵箱內濕度對維持培養基的滲透壓也有很重要的作用。大部分細胞適應的滲透壓在260-320mOsm/kg。濕度不夠時(shí)，培養基蒸發(fā)，液體的滲透壓就會(huì )升高。

8、培養基在使用前需提前從冰箱拿出，使其恢復至室溫或者37度水浴。

9、操作過(guò)程中，如果槍頭中已經(jīng)有培養基或其他液體成分，不要再經(jīng)過(guò)酒精燈被高溫加熱。高溫不僅會(huì )使有效成分失效，更有可能產(chǎn)生有毒物質(zhì)。

10、我們購買(mǎi)的培養基瓶上都會(huì )標注避光保存，這是因為培養基中的某些成分遇光會(huì )產(chǎn)生過(guò)氧化氫，具有細胞毒性。我們在超凈臺中處理細胞時(shí)，因為時(shí)間較短，不會(huì )產(chǎn)生太大問(wèn)題。但是如果長(cháng)時(shí)間放置在室外或燈光下照射，或者有的冷藏冰柜的門(mén)是玻璃的，就會(huì )造成培養基質(zhì)量的下降。

三、血清

1、血清分為：

a)新生牛血清（新生的小牛5天內取血）；

b)小牛血清（16周內的小牛取血）；

c)胎牛血清（剖腹取出胎兒制成的）。

2、我們買(mǎi)來(lái)的血清多處于冰凍狀態(tài)，滅活前放到4度冰箱，使其緩慢溶化。56度水浴45分鐘滅活，滅活后冷卻至室溫再放回冰箱冷凍層中。滅活是滅活補體系統中具有蛋白酶活性的成分，對于一些難養的細胞，滅活補體是很重要的。但是滅活的溫度也可能會(huì )破壞血清中的生長(cháng)因子，所以到底該不該滅活血清，還沒(méi)有一個(gè)很明確的標準，可能還是要視情況而定吧。

3、血清在溶化過(guò)程中，纖維蛋白原會(huì )轉變成纖維蛋白，所以有時(shí)我們會(huì )看到絮狀物，但是這種情況是不影響血清的質(zhì)量的。

四、傳代

1、貼壁細胞傳代時(shí)，先用消化液潤洗一遍；棄掉后，再加入適量消化液置于孵箱或鏡下觀(guān)察消化；當細胞變圓，彼此之間產(chǎn)生空隙，加入等量或大量的培養基終止消化，培養基中的血清可以抑制胰蛋白酶的活性。

2、這里我沒(méi)有明確提到胰蛋白酶的濃度，并不是說(shuō)濃度越高越好。胰蛋白酶底物的特異性差，會(huì )破壞細胞膜成分。PH8.0，37度環(huán)境下，消化液的消化能力是最強的。培養基中的血清會(huì )降低胰酶的消化能力，所以每次消化前，也要用PBS反復沖洗干凈培養皿。日常用的比較多的消化液濃度：a)0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA

b)0.05%胰蛋白酶+0.02%EDTA 

c)0.25%胰蛋白酶

3、傳代后如果細胞不貼壁，可能的原因是胰蛋白酶消化過(guò)度或者沒(méi)有清洗干凈EDTA。

4、懸浮細胞傳代時(shí)，正常收集細胞、離心濃縮、用培養基重懸就可以了。懸浮細胞每次換液都需要離心重懸，但是由于懸浮細胞一般會(huì )處于單細胞層生長(cháng)，有的時(shí)候生長(cháng)速度很快，重懸后如果不晃動(dòng)培養皿，就會(huì )看到細胞成團；如果經(jīng)常顯示懸浮細胞大量抱團生長(cháng)，也有可能是培養基中的血清問(wèn)題、或者鈣鎂離子濃度的變化造成了細胞間的粘附力改變。

五、細胞死亡及生長(cháng)異常

1、首先講一下細胞生長(cháng)緩慢的原因：

a)更換了血清或者培養基，細胞需要一段時(shí)間適應一下；

b)由于細胞的特殊種類(lèi)，培養基中缺少某些生長(cháng)因子；

c)培養基中有少量真菌或者細菌污染；

d)傳代的時(shí)候細胞密度過(guò)低；

e)細胞狀態(tài)老化；

f)支原體污染。

2、解決上述問(wèn)題的方法：

a)如果實(shí)驗室沒(méi)有某種細胞最適宜的培養基，可以先用原培養條件凍存一些，然后逐漸增加新的培養基比例，25%、50%、75%到100%，傳代3-5次后，讓細胞慢慢適應。

b)判斷是不是培養基發(fā)生污染，可以先不加抗生素，觀(guān)察細胞狀態(tài)。

c)增加細胞的接種密度。

d)發(fā)現細胞老化的時(shí)候，及時(shí)更換新的細胞。

e)如果懷疑是支原體污染，一定要隔離疑似污染的培養皿，及時(shí)清潔消毒孵箱。

3、造成細胞死亡的原因：

a)細胞消化過(guò)度；

b)沒(méi)有及時(shí)換液，營(yíng)養成分消耗殆盡；

c)如果前一天細胞的狀態(tài)很好，換液之后就全死了，應該考慮是否是培養基或者血清的問(wèn)題。

4、如何判定細胞是否發(fā)生支原體污染：可以選用直接培養法、熒光染色或PCR方法檢測，比較常用的是PCR。當細胞發(fā)生支原體污染時(shí)，原則上是能夠去除支原體的，但是整個(gè)過(guò)程耗時(shí)耗力，還要考驗個(gè)人操作能力。所以如果不是處于細胞存量很少的情況下，建議發(fā)現污染時(shí)立刻棄掉，重新培養。

5、如果孵箱中只是某種細胞持續性大量死亡，而其他細胞狀態(tài)都沒(méi)問(wèn)題的話(huà)，基本上可以確定就是孵箱存在特異性感染這類(lèi)細胞的真菌或細菌，遇到這種情況，小六兒也不知道該怎么做，只能是先停一段時(shí)間看看。。。。。。

6、其他注意事項：每個(gè)星期都要更換孵箱底盤(pán)中的水（紫外照射后超純水）；每?jì)芍芟疽淮畏跸洌?5%酒精擦拭一遍后，再用0.1%新潔爾滅擦拭一遍（都用超純水配制）；可以在孵箱底部放一個(gè)燒杯，里面放入飽和硫酸銅，可以抑制霉菌生長(cháng)。不過(guò)也有人說(shuō)硫酸銅會(huì )改變孵箱的PH值，如果不是孵箱污染的情況很?chē)乐?，建議不要使用。